بررسی میزان بیان موثر و کارآیی آنزیم جهش یافته لاکاز در موقعییت asp 500

لاکازها (1.10.3.2 ec؛ پارا دی فنول دی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده¬ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارند. محدود بودن دامنه اطلاعاتی در ارتباط با ساختار و عملکرد لاکازها، آنزیم اخیر را کاندیدای مناسبی جهت راهکارهای مهندسی پروتئین معرفی می نماید. در این مطالعه، آنزیم لاکاز جدا شده از bacillus hr03 که علاوه بر توانایی لاکازی و تیروزینازی دارای خاصیت بیلی روبین اکسیدازی نیز می باشد، مورد استفاده قرار گرفت. محدودیت کاربری های این آنزیم متاثر از بیان پایین آن در میزبان اشریشیا کولی است. جهت ارزیابی وبهبود بیان موثر، کارایی و پایداری آنزیم، جهش های d500g, d500a, d500s d500l, d500e و glycine insertion در جایگاه asp 500 واقع در انتهای کربوکسیل لوپ متصل شونده به مس نوع 1 و به روش جهش زایی هدفدار صورت گرفت. در جایگزینی آسپارتیک اسید با باقیمانده ی گلایسین که دارای حداقل ممانعت فضایی است، فعالیت ویژه حداکثری مشاهده شد. در جهش یافته اخیر، کارایی کاتالتیک به میزان حدود 2/3 برابر به همراه افزایش بیان به میزان حدود 3 برابر، افزایش فعالیت حدود 7/3 برابری را موجب می گردد. جایگزینی آسپارتیک اسید با گلوتامیک اسید و لوسین باعث افزایش نیمه عمر آنزیم در دمای بالا می شود. علاوه بر مطالعات ترمودینامیکی، پارامترهای سینتیکی در حضور سوبستراهای 2, 2′-azino-bis (3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid))) ((abts، syringaldazine (sgz) و بیلی روبین انجام گرفت و ویژگی سوبسترایی در میان جهش یافته ها مشاهده نشد. پایداری و تغییرات ساختاری به کمک روش های سینتیکی، فلورسانس و دو رنگ نمایی حلقوی (cd) نیز مورد مطالعه قرار گرفت.